Главная Биохимический анализ крови Методы исследования (для профессионалов медицины) Определение общего холестерина в крови (метод Илька)
Биохимический анализ крови - Методы исследования (для профессионалов медицины)

холестеринПринцип метода определения общего холестерина

В сильнокислой безводной среде холестерин взаимодействует со смесью серной, уксусной кислот и уксусного ангидрида. В ходе реакции холестерин последовательно окисляется. При этом каждая стадия реакции сопровождается образованием молекулы холестерина, которая имеет на одну двойную связь больше, чем соединение, из которого она образова­лась.

В результате конечного окисления иона 3,5-холестодиена по­лучается окрашенное соединение, растворенное в серной кислоте и дающее максимум абсорбции при 410 и 610 нм. Из-за неустойчи­вости окраски соединения время фотометрирования должно быть точно выдержано.

Реакционная смесь со стандартным раствором холестерина имеет изум­рудный цвет. Однако пробы сыворотки могут давать зеленый, го­лубой, бурый цвета. Это связано с тем, что в результате образова­ния эндогенного тепла в реакцию вступают многие компоненты сыворотки крови. Кроме того, в реакции Либермана—Бурхарда свободный холестерин и его эфиры образуют цветные комплексы с раз­ным коэффициентом молекулярного поглощения. В случае высо­кого содержания эфиров оптическая плотность  холестерина оказывается более высокой. Поскольку на прямое определение холестерина влияют многие факторы, реакцию холестерина со смесью Либермана—Бурхарда нельзя считать специфичной.

Прямой метод определения холестерина относительно прост в исполне­нии и недорог. Однако токсичность и способность вызывать кор­розию системы в современных анализаторах ограничивают применение метода. В крупных лабораториях предпочтение отдают ферментативным методам определения холестерина.

Нормальный уровень общего холестерина в крови по методу Илька: 4,65—6,46 ммоль/лит (180—250 миллиграмм/децилитр).

При концентрации холестерина в пробе выше 16 ммоль/литр сы­воротку разводят физиологическим раствором в соотношении 1:1 (результат).

Реакция чувствительна на изменение температуры, поэтому необходимо особенно соблюдать охлаждение реакционной смеси после добавки серной кислоты.

Билирубин в концентрации выше 50 мкмоль/литр влияет на ре­зультат анализа. Интерференцию билирубина можно исправить расчетом. Содержание 17 мкмоль/литр билирубина приводит к за­вышению содержания холестерина в сыворотке примерно на 0,1 моль/литр.

Сыворотка должна быть негемолизированной.

Необходимые реактивы для определения холестерина

1.  Ледяная уксусная кислота.

2.  Концентрированная серная кислота.

3.  Уксусный ангидрид.

4.  Абсолютный этиловый спирт.

5.  Кислотная смесь: в сухую колбу наливают 10 миллилитров ледяной уксусной кислоты и 50 миллилитров уксусного ангидрида, затем при по­стоянном перемешивании и охлаждении добавляют 10 миллилитров кон­центрированной серной кислоты. Смесь должна быть бесцветной или слегка желтоватой. Хранить в холодильнике в темной склян­ке с притертой пробкой.

6. Калибровочный раствор: 232 миллиграмма холестерина растворяют в 2—3 миллилитрах хлороформа и доводят до объема 100 миллилитров абсолютным этиловым спиртом. Приготовленный раствор содержит холесте­рин в концентрации 6 ммоль/литр.

Ход определения холестерина

К 2,1 миллилитра кислотной смеси медленно по стенке пробирки до­бавляют 0,1 миллилитра плазмы или сыворотки без признаков гемолиза, перемешивают встряхиванием и ставят на 20 минут в термостат или водяную баню при температуре 37°С, затем фотометрируют в кювете с длиной оптического пути 0,5 сантиметров против реактива при длине волны 625 нм.

Построение калибровочной кривой и расчет. К 0,05—0,2 миллилитра калибровочного раствора добавляют такое количество кислотной смеси, чтобы общий объем был 2,2 миллилитра, перемешивают и выдержи­вают 20 минут при температуре 37°С, так же как и опытные пробы, а затем фотометрируют. Окраска калибровочной пробы, в которую взято 0,05 миллилитра калибровочного раствора, соответствует содержанию холестерина в плазме 3 ммоль/литр; пробы, в которую взято 0,1 миллилитра, — содержанию 6 ммоль/литр и так далее

Примечания

1. Попадание воды приводит к помутнению раствора.
2. Следы гемолиза или желтушность исследуемой плазмы или сыворотки служат причинами завышенных результатов.
3. Можно использовать для фотометрии и кюветы с длиной оптического пути 1 сантиметр, тогда количество кислотной смеси удваи­вают, а количество исследуемого материала остается прежним.

Данный метод определения содержания холестерина в крови относят к колориметрическим. 

 

Добавить комментарий

Защитный код
Обновить