Главная Биохимический анализ крови Методы исследования (для профессионалов медицины) Определение железа по цветной реакции с сульфонированным батофенантролином
Биохимический анализ крови - Методы исследования (для профессионалов медицины)

железоПринцип метода определения железа в крови

Белки осаждают трихлоруксусной кислотой, которая при про­гревании разрушает также комплекс железа с трансферрином. Для установления оптимальной величины рН 4,8—5,0 добавляют аммония ацетат, а для восстановления всего железа — гидразин. Двухвалентное железо образует окрашенный комплекс с батофенантролином, который переведен в сульфатированную форму до­бавлением хлорсульфоновой кислоты.

Необходимые реактивы определения железа

1.   Трихлоруксусная кислота, 20%-ная.

2.   Аммония ацетат: 70 г ацетата аммония (CH3COONH4) раство­ряют в воде, объем доводят до 100 мл, препарат гигроскопичен.

3.   Гидразина сульфат, насыщенный раствор, готовят, заливая 2,5 г препарата 100 мл воды.

4.  Раствор сульфонированного батофенантролина: в пробирке к 100 мг батофенантролина (4,7-дифенил1,10-фенантролина) приливают 0,5 мл хлорсульфоновой кислоты, нагревают на кипя­щей водяной бане в течение 30 секунд, охлаждают и медленно прили­вают 10 мл воды, после чего снова нагревают на водяной бане в течение 5 минут и разбавляют 100 мл воды, добавляя 5 н NaOH, устанавливают рН 4,0 и доводят объем водой до 200 мл.

5. Калибровочный раствор железа, содержащий 30 мкмоль/литр. Сначала готовят раствор соли Мора (железоаммиачные квасцы, аммоний-железо II сернокислое), FeSО4 · (NH4)SО4 · 6Н2О, со­держащий 3 ммоль/литр, растворяя 1,178 г в 5 мл 0,3 н НС1 и доводя объем до 1 л водой, содержащей в 1 литре 1 мл концентрированной сер­ной кислоты. Этот раствор разводят подкисленной водой в 100 раз; получается раствор, содержащий 30 мкмоль/литр, или 1,67 мкг/мл.

Ход определения железа

К 2 мл исследуемой сыворотки прибавляют 2,5 мл воды и 1,5 мл 20%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают и ста­вят на 15 минут на водяную баню температуры 90—95°С. Затем центрифугируют в течение 20 минут при скорости 2000 об./мин и отбира­ют 4 мл прозрачного слоя, к которым приливают 0,35 мл 70%-ного раствора аммония ацетата и 0,3 мл раствора сульфата гидразина.

Смесь фотометрируют при длине волны 535 нм в кюветах с длиной оптического пути 1 сантиметр, затем прибавляют 0,4 мл раствора сульфонированного батофенантролина, оставляют на 1 ч и снова фотомет­рируют при той же длине волны. Обе фотометрии выполняют против холостого опыта, в котором берут вместо исследуемой сыворотки 2 мл воды.

Калибровку проводят так же, как и основной опыт, но вместо сыворотки берут 2 мл калибровочного раствора.

Расчет сывороточного железа (мкмоль/литр) выполняют по фор­муле:

Еоп1 - Еоп2  / Ек1 - Ек2 · 30

где Еоп1 и Еоп2 — отсчеты опытной пробы до и после прибавления раствора сульфонированного батофенантролина;

Ек1 и Ек2 — соответственно результаты фотометрии калибро­вочной пробы;

30 — содержание железа в калибровочном растворе, мкмоль/литр.

Надо тщательно следить за содержанием железа в дистилли­рованной воде и реактивах, используя в случае необходимости бидистиллированную воду, приготовленную в стеклянном пере­гонном аппарате. Если после удаления белков не удается набрать точно 4 мл надосадочной жидкости, можно взять меньшее ее ко­личество и сделать поправку при расчете или же взять точно та­кое же количество калибровочного раствора.

P.S. Имеете время и желание изменить свою профессию и расширить границы знаний? Посетите школу парикмахеров стилистов и запишитесь на занятие. Будет интересно и познавательно. 

 

Добавить комментарий

Защитный код
Обновить