Главная Биохимический анализ крови Методы исследования (для профессионалов медицины) Определение адениловых нуклеотидов эритроцитов мето­дом тонкослойной хроматографии
Биохимический анализ крови - Методы исследования (для профессионалов медицины)

адениловые нуклеотидыПринцип метода определения адениловых нуклеотидов

Белки эритроцитов осаждаются хлорной кислотой, избыток которой удаляется в виде калиевой соли. Безбелковый фильтрат хроматографируется в тонком слое на пластинах «Силуфол», нуклеотиды идентифицируются в ультрафиолетовом свете и опре­деляются по светопоглощению элюатов.

Необходимые реактивы для определения адениловых нуклеотидов

1. Диоксан.

2. Изопропиловый спирт.

3. Аммиак, концентрированный раствор.

4. Кислота хлорная, 0,8 н (8%-ная НСlO4).

5. Калия карбонат, раствор 2 моль/литр готовят, растворяя 27,6 г карбоната калия (поташ, К2СО3) в воде, объем доводят до 100 мл. В случае необходимости препарат предварительно сушат при температуре 105—110°С.

6. Подвижная фаза для хроматографии — смешивают 40 мл диоксана, 20 мл изопропилового спирта, 40 мл воды и 10 мл кон­центрированного раствора аммиака. Можно использовать и более простую систему, которую готовят без изопропанола, смешивая 40 мл диоксана, 40 мл воды и 10 мл раствора аммиака.

7. НС1, 0,1 н.

8. Натрия хлорид, 0,85%-ный раствор (изотонический раст­вор).

    9.  Пластины для тонкослойной хроматографии «Силуфол».


    Ход определения адениловых нуклеотидов

    Кровь берут с гепарином, добавляя его из расчета 12 ME на 1 мл крови. Эритроциты отделяют центрифугированием, плазму отсасывают, а клетки 3 раза промывают холодным изотониче­ским раствором натрия хлорида, каждый раз центрифугируя по 20 мин при скорости 3000 об./мин.

    К 1 мл эритроцитной массы добавляют 1 мл раствора хлорной кислоты, перемешивают и через несколько минут осадок отделяют центрифугированием. К 1 мл надосадочной жидкости прибавляют 0,1 мл раствора калия карбоната и оставляют на холоде, пока пол­ностью не выпадут кристаллы образовавшегося перхлората ка­лия. 0,05—0,1 мл холодной надосадочной жидкости (если она со­греется, кристаллы частично растворяются) наносят в виде полоски на пластину «Силуфол» и проводят восходящую хрома­тографию в течение 60—90 минут в смеси диоксана, изопропилово­го спирта и аммиака.

    Перед началом хроматографии камера должна быть насыщена парами растворителя, фронт растворителя должен пройти рас­стояние не менее 3/4 пластины; если он не пройдет его, то наибо­лее вероятная причина этого — плохое насыщение камеры пара­ми подвижной фазы или плохая герметизация камеры.

    Вынутые из камеры пластины высушивают на воздухе и про­сматривают в коротком ультрафиолетовом свете (на ультрахемоскопе Блюмберга или другом аналогичном приборе), находят пят­на нуклеотидов и обводят их острым предметом. В этой системе быстрее всего движется АМФ, медленнее — аденозина трифосфат (АТФ). Порошок с от­меченных мест пластины соскабливают и элюируют 3 мл 0,1 н НС1. Определяют светопоглощение надосадочной жидкости при длине волны 260 нм.

    При налаживании методики рекомендуется провести определе­ние в калибровочном растворе, содержащем в 1 мл 30—60 нмоль (15—30 мкг) ампулированного препарата аденозина трифосфата (АТФ), который непо­средственно наносят на хроматографическую пластину так же, как и нейтрализованный хлорный экстракт. Эти препараты обыч­но, помимо аденозина трифосфата (АТФ), содержат также аденозина дифосфат (АДФ) и АМФ.

    Расчет проводят исходя из молярных коэффициентов экстинк­ции: для аденозина трифосфата (АТФ) — 14 600, для аденозина дифосфата (АДФ) — 15 000, для АМФ — 14 700. Если для хроматографии было взято 0,1 мл нейтрализованного экстракта и окончательный объем после элюации был 3 мл, разве­дение составляет 1:63, поэтому для того чтобы выразить концент­рацию аденозина трифосфата (АТФ) в мкмоль/литр, надо величину умножить на 4315, для аденозина дифосфата (АДФ) коэффициент составляет 4200, для АМФ — 4286. Если же для хроматографии берут 0,05 мл нейтрализованного экстракта, коэффициенты должны быть в 2 раза выше.

    Нормальные величины: содержание аденозина трифосфата (АТФ) — 726 X 2,4 мкмоль/литр, содержание аденозина дифосфата (АДФ) — 262 X 1,2 мкмоль/литр, АМФ — 4,1 X 1,3 мкмоль/литр.

    P.S. Купил кроссовки Nike air max 2013. Удобно, красиво, практично - в общем очень приятная и полезная получилась покупка. Ходить можно часами, а особенно с моим плоскостопием. 

     

    Добавить комментарий

    Защитный код
    Обновить