Главная Биохимический анализ крови Методы исследования (для профессионалов медицины) Определение нуклеотидов эритроцитов электрофоретическим методом
Биохимический анализ крови - Методы исследования (для профессионалов медицины)

эритроцитПринцип метода определения нуклеотидов эритроцитов

Белки эритроцитов осаждают трихлоруксусной кислотой, надосадочную жидкость подвергают электрофорезу на бумаге в цитратном буфере рН 5,1. Пятна аденозина трифосфата (АТФ) и аденозина дифосфата (АДФ) идентифицируют в ультрафиолетовом свете, вырезают, элюируют и количественно определяют прямой спектрофотометрией в ультрафиолетовом свете при длине волны 260 нм.

Необходимые реактивы для определения нуклеотидов эритроцитов

1.   Натрия цитрат трехзамещенный.

2.   Гепарин, ампутированный препарат, активность 5000 ЕД/мл.

3.  Натрия хлорид 0,85%-ный раствор (физиологический раствор).

4.   Кислота трихлоруксусная 150 грамм/литр(15%-ный раствор).

5.   HCl 0,01 н.

6.   Цитратный буфер рН 5,1, готовят, растворяя в воде 17,65 г натрия цитрата трехзамещенного и 4,41 г лимонной кислоты. Объем доводят до 1 литра.

7. Бумага для электрофореза, разрезанная на ленты 35 · 200 мм.

Ход определения нуклеотидов эритроцитов

Кровь берут с гепарином из расчета 0,1 мл на 5 мл крови. Эрит­роциты отделяют центрифугированием, плазму отсасывают, а клетки дважды промывают изотоническим раствором натрия хлорида при температуре 4°С, каждый раз центрифугируя, отса­сывая надосадочную жидкость и вновь ресуспендируя в новой порции раствора. К 0,5 мл эритроцитной взвеси добавляют 0,5 мл 15%-ной трихлоруксусной кислоты, перемешивают палочкой, выдерживают при температуре 4°С в течение 10 минут и центрифу­гируют. Надосадочную жидкость используют для определения нуклеотидов.

Электрофоретическую камеру заполняют цитратным буфером рН 5,1 и смачивают бумагу для электрофореза согласно правилам работы на приборе. На место старта равномерной поперечной по­лосой наносят 0,05 мл исследуемого трихлоруксусного экстракта и проводят электрофорез при напряжении 12—14 В/см при силе тока 0,5—1 мА на 1 сантиметр поперечного сечения ленты в течение 3, 5 часов. После этого электрофореграммы высушивают в темноте и рас­сматривают при освещении коротким ультрафиолетовым светом (длина волны меньше 300 нм, можно пользоваться ультрахемоскопом Блюмберга или другим аналогичным прибором). Бумага слегка флюоресцирует за счет примесей, а адениловые нуклеотиды, которые сильно поглощают свет в этой области, видны в ви­де темных пятен. Ближе к старту находится аденозина дифосфат (АДФ), дальше от стар­та — аденозина трифосфат (АТФ). Контуры пятен обводят карандашом, вырезают и элюируют 5 мл 0,01 н НС1 в течение 4 часов. Одновременно экстра­гируют аналогичный участок бумаги, не содержащий нуклеотидов; этот раствор используют в качестве холостого опыта. Экс­тинкции всех растворов измеряются при длине волн 260 и 290 нм в кюветах с длиной оптического пути 1 сантиметр, из первой величины вычитают вторую.

Расчет основывается на данных молярного коэффициента экстинкции при длине волны 260 нм, который у разных нуклеотидов несколько различается, однако этими небольшими различия­ми можно пренебречь и принять его равным 14,2 · 103. Это зна­чит, что такая величина оптической плотности получится, если фотометрировать в кювете с длиной оптического пути 1 сантиметр раствор концентрации 1 моль/литр и вычесть из этой величины оптическую плотность при 290 нм. Для раствора концентрации 1 мкмоль/литр величина будет 0,0142.

В данном методе окончательное разведение пробы в 200 раз (нуклеотиды из 25 мкл эритроцитной массы оказываются в 5 мл), поэтому расчет производят по формуле:

Е · 200/0,0142 =  Е · 14 085 мкмоль /л эритроцитарной массы,

где Е — разность оптических плотностей, измеренных при дли­нах волн 260 и 290 нм.

Нормальные величины: для аденозина трифосфата (АТФ) — 600—1400 мкмоль/литр, для аденозина дифосфата (АДФ) — 250—800 мкмоль/литр, отношение молярных концентраций аденозина трифосфата (АТФ) / аденозина дифосфат (АДФ) в норме 2.

P.S. Покупки в Америке стоят намного меньше, чем в нашем отечестве. Поэтому пользуюсь услугами Международного интернет магазина Под Диваном. Получила на днях посылочку - все на своих местах, как и заказывала. 

 

 

Добавить комментарий

Защитный код
Обновить