Главная Биохимический анализ крови Методы исследования (для профессионалов медицины) Унифицированный метод определения фосфора после осаж­дения белков трихлоруксусной кислотой
Биохимический анализ крови - Методы исследования (для профессионалов медицины)

фосфорПринцип метода определения фосфора

При осаждении белков крови трихлоруксусной кислотой все фосфолипиды осаждаются вместе с белковым сгустком, а неорга­нический и кислоторастворимый фосфор остаются в растворе.

Белковый сгусток минерализуется нагреванием с хлорной кисло­той, и фосфор определяется эйконогеновым методом. В связи с тем, что белки плазмы не содержат фосфора, весь осаждаемый трихлоруксусной кислотой фосфор входит в состав фосфолипидов.

Необходимые реактивы для определения фосфора

1.   Кислота хлорная 57%-ная, ее концентрация должна быть 5,7 н, что проверяется титрованием. Если концентрация значительно ниже, что часто случается, так как препарат может содержать 40 или 50 % НСlO4, соответственно увеличивается количество реактива, используемого при минерализации.

2.   Кислота трихлоруксусная, 100 грамм/литр(10%-ный).

3.   Аммоний молибденовокислый, раствор 40 г/л. Готовят, раст­воряя 4 г (NH4) Мо7О24 х 4Н2О в 100 мл воды.

4.   Натрий кислый сернистокислый.

5.   Натрий сернистокислый безводный.

6.   Эйконоген, раствор.

7. Калибровочный раствор. Основной калибровочный раствор, содержащий 50 ммоль фосфора в 1 литре, разводят водой в 50 раз; по­лучается раствор, содержащий 1 мкмоль/мл.

Ход определения фосфора

К 0,2 мл исследуемой сыворотки добавляют 3 мл воды и мед­ленно 3 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, через 1—2 минуты центрифугируют, надосадочную жидкость сливают — пробирку переворачивают и дают стечь жидкости. К осадку добав­ляют 1 мл 57%-ной хлорной кислоты; если ее концентрация ниже, соответственно увеличивают количество кислоты, переносят в колбу или в большую пробирку для сжигания и минерализуют.

Минерализация — наиболее ответственный этап определения. Дигидрат хлорной кислоты НСlO4 х 2Н2О кипит при температу­ре 203°С, при более низкой температуре из пробы удаляют воду, а при повышении температуры начинает улетучиваться сама хлорная кислота. Температурный режим должен быть подобран так, чтобы пары дигидрата хлорной кислоты конденсировались на стенках, и в виде капелек опускались на дно, где опять испаря­лись, и так далее. При оптимальных условиях минерализация заканчи­вается за несколько часов; если температура слишком низкая, она затягивается, если слишком высокая, хлорная кислота улетучива­ется, и проба будет испорчена. Лучше всего сжигать пробы в больших пробирках 20 X 200 мм, которые устанавливают в по­догреваемом электричеством металлическом блоке (каждую про­бирку в отдельном гнезде). Сверху пробирки прикрывают спе­циальными затычками или колпачками, на которых также конденсируются и стекают вниз пары хлорной кислоты. Высота блока должна быть 2—3 сантиметра; большая часть пробирки, которая на­ходится над блоком, остается свободной и относительно холод­ной, на ней и конденсируется хлорная кислота. Желательно, что­бы температура в блоке поддерживалась на уровне 200—210°С с помощью электронного реле, соединенного с контактным тер­мометром (как в термостате). Такое устройство позволяет сжи­гать большое количество проб с наименьшими затратами време­ни лаборанта, но можно работать также с круглодонными колбами с длинными горлышками (колбы Къельдаля) на песчаной бане, но это требует большего внимания за ходом минерали­зации. Внешний признак того, что минерализация окончилась, — просветление проб, но он может быть обманчивым. В то же время слишком длительное нагревание приводит к потерям, поэтому пе­ред началом серийных анализов надо отработать режим сжига­ния, проверяя воспроизводимость в серии.

После охлаждения к минерализованной пробе прибавляют 7 мл воды, 1 мл раствора молибденовокислого аммония и 1 мл раство­ра эйконогена, объем доводят водой до 10 мл. Через 20 минут фотометрируют в кюветах с длиной оптического пути 1 снтиметр при длине волны 630—690 нм против холостого опыта, в который берут 0,8 мл хлорной кислоты, 7 мл воды и далее проводят цветную реакцию так же, как и в опыте.

Для построения калибровочной кривой минерализуют калиб­ровочные пробы, содержащие 0,2—1 мкмоль фосфора. Для этого к ним прибавляют по 1 мл хлорной кислоты и ставят нагревать вместе с опытными пробами, после чего проводят цветную реак­цию. По калибровочному графику вычисляют содержание фосфора в пробе, эту величину умножают на 5 и получают концентра­цию мкмоль/мл или ммоль/литр.

После минерализации образовавшийся неорганический фос­фор может быть определен любым методом, в том числе и наибо­лее чувствительным с малахитовым зеленым. Иногда в процессе минерализации образуется некоторое количество пирофосфата, что приводит к заниженным результатам анализа. В этом случае пробу после разведения водой ставят на несколько минут на ки­пящую водяную баню, при этом пирофосфат гидролизуется.

P.S. Справка в бассейн нужна на каждые 3 месяца посещения. Обходить всех врачей, тратить время и нервные клетки на получение очередной бумажки не очень хочется. Лучше довериться профессионалам - быстро и просто.

 

Добавить комментарий

Защитный код
Обновить