Главная Биохимический анализ крови Методы исследования (для профессионалов медицины) Определение уровня щелочной фосфатазы в крови
Биохимический анализ крови - Методы исследования (для профессионалов медицины)

 

щелочная фосфатазаПринцип метода определения щелочной фосфатазы

Щелочная фосфатаза (щелочная фосфогидролипаза моноэстеров ортофосфорной кислоты) расщепляет в метил-В-глюкаминовом буфере 4-нитрофенилфосфат с образованием 4-нитрофено-ла и фосфата. Щелочная фосфатаза (ЩФ) активирована хлоридом натрия. Мерой каталитической концентрации фермента является количество освобожденного 4-нитрофенола, который определяют фотометрически, либо кинетическим методом, либо методом по­стоянного времени после остановки ферментативной реакции ингибитором щелочной фосфатазы, который блокирует активный центр фермента.

Кинетическим методом можно без разведения анализировать сыворотки до каталитической концентрации щелочной фосфатазы (ЩФ) 30 мккат/л. Ме­тодом константного времени можно без разведения анализиро­вать пробы до 7 мккат/л. При каталитической концентрации щелочной фосфатазы (ЩФ), превышающей эти величины, пробы следует развести физиологическим раствором и анализ произвести повторно (результат умно­жить на разведение). Объемы отдельных растворов и пробы можно модифицировать при условии соблюдения взаимных соотноше­ний объемов, указанных в описании хода инкубационной смеси. Пределы активности щелочной фосфатазы (ЩФ) при температуре 37°С (мккат/л):

- мужчины — 0,90—2,29;

- женщины — 0,74—2,10;

- дети до 12 лет — 1,20—6,30.

Необходимые реактивы для определения щелочной фосфатазы

1. n-нитрофениловый эфир фосфорной кислоты, динатриевая соль.

2. Соляная кислота, 0,001 моль/л.

3. n-нитрофенилфосфат натрия, 4 грамм/литр раствор в 0,001 моль/л раствора НО: 0,4 грамма n-нитрофенилфосфата помещают в мерную кол­бу вместимостью 100 мл и доливают до метки 0,001 моль/л раство­ром НСl. В связи с тем, что в продаже чаще имеется бариевая соль n-нитрофенилфосфата, то перевод ее в натриевую соль осуществля­ется следующим способом: к навеске n-нитрофенилфосфата бария, соответствующей получению 9 грамм/литрраствора и помещенной в фарфо­ровую ступку, добавляют небольшими количествами 0,001 моль/л раствор НС1 в процессе растирания соли в ступке в течение 10 минут. Добавлением насыщенного раствора сульфата натрия (1 мл на 100 мл раствора) бариевую соль переводят в натриевую.

    Через 5 минут полученный раствор n-нитрофенилфосфата нат­рия фильтруют в делительную воронку, где затем взбалтывают с равным объемом водонасыщенного бутилового спирта. После разделения слоев жидкости в делительной воронке (вверху — бутанол, внизу — постепенно обесцвечивающийся субстратный раствор) бутанол выливают, а субстратный раствор подвергают описанной выше процедуре очистки еще 2—3 раза, пока он не станет совершенно бесцветным. После бутанола производят экстракцию водонасыщенным эфиром 1—2 раза. Реактив не дол­жен содержать свободного n-нитрофенола, отсутствие которого в субстратном растворе проверяется следующей пробой: к 1 мл субстратного раствора прибавляют 10 мл 0,02 моль/л раствора ед­кого натра и измеряют на фотоэлектроколориметре (ФЭКе) при длине волны 400—420 нм (фиолетовый светофильтр).

    Экстинкция должна быть меньше 0,08; если экстинкция больше 0,08, необходимо удалить свободный       n-нитрофенол. Для этого реактив экстрагируют 2 или 3 раза рав­ными объемами бутилового спирта и один раз — эфиром. Затем удаляют следы эфира выдерживанием на воздухе. Бутиловый спирт и эфир должны иметь нейтральную реакцию. Если реактив не выдерживает указанный выше тест, то экстрагирование повто­ряют.

    Хранят раствор в холодильнике в замороженном состоянии в течение 2—3 недель.

    4. Аминоуксусная кислота (гликокол, глицин).

    5. Магния хлорид 6-водный.

    6. Натр едкий; растворы 0,1 моль/литр, 0,02 моль/литр, не содержа­щие углекислого газа.

    7. Буферный раствор — 0,05 моль/литр глициновый буфер с до­бавлением катализатора хлорида магния — 95 миллиграмм/литр: 375 мг глици­на и 10 мг MgCl2 х 6Н2О растворяют в 42 мл 0,1 моль/литр раствора едкого натра и доводят объем водой до 100 мл.

    8. Субстратно-буферный раствор готовят смешиванием рав­ных частей растворов 3 и 7, рН раствора 10,5. При смешивании 2 мл раствора с 10 милилитрами 0,02 моль/литр раствора едкого натра реактив не должен давать экстинкцию на фотоэлектроколориметре (ФЭКе) более 0,1 (толщина слоя — 1 сантиметр, длина волны — 400—420 нм). В противном случае раствор не годится или подлежит реэкстрагированию бутанолом или эфи­ром. После экстракции необходимо снова установить рН. Хранят в холодильнике в течение 2—3 дней.

    9.  n-нитрофенол — калибровочный раствор 5 X 10-5 моль/литр: 696 миллиграмм n-нитрофенола растворяют в 0,02 моль/литр растворе едкого натра и доводят этим же раствором объем до 1 литра; 1 миллилитр раствора содержит 5 мкмолей n-нитрофенола.

    Ход определения щелочной фосфатазы

    Опытная проба: в пробирки вносят по 1 миллилитру субстратно-буфер­ного раствора, прогревают при температуре 37°С в течение 5 минут, затем добавляют по 0,1 миллилитру сыворотки. Содержимое пробирок пе­ремешивают и инкубируют в течение 30 минут при температуре 37°С. После инкубации пробирки переносят в водяную баню со ль­дом, а затем добавляют по 10 миллилитров 0,02 моль/литр раствора едкого натра и тщательно перемешивают. Через 5 минут пробы измеряют на фотоэлектроколориметре (ФЭК) при длине волны 400—420 нм (фиолетовый светофильтр) в кюве­те с толщиной слоя в 1 сантиметр против холостой пробы. Холостую про­бу ставят так же, как опытную, но сыворотку добавляют после ин­кубации.

    Расчет производят по калибровочному графику.

    Построение калибровочного графика

    Из рабочего калибровочного раствора готовят ряд разведений, как указано в таблице, и измеряют оптическую плотность раство­ров при условиях, аналогичных опытным, против 0,02 моль/литр раствора едкого натра.

    Исследование активности щелочной фосфатазы

    Номер пробирки

    Рабочий калибро­вочный раствор, мл

    Содержание п-нитрофе-нола, мкмоль

    0,02 моль/л раствор NaOH, мл

    Активность

    ЩФ, нмоль/(сХл)

    1

    1

    0,05

    10,1

    278

    2

    2

    ОД

    9,1

    556

    3

    3

    0,15

    8,1

    834

    4

    5

    0,25

    1390

    5

    7

    0,35

    4,1

    1946

    P.S. Сегодня получить качественную и адекватную медицинскую помощь реально в любой стране мира. Клиники Австрии, Германии, Израиля, Испании, Кубы и многих других стран оказывают довольно широкий спектр медицинских услуг. Так, клиника Текнон в Барселоне (Испания) является многопрофильным центром, объединяя несколько десятков направлений, начиная от аллергологии, заканчивая ядерно-магнитными исследованиями и эстетической хирургией.

     

    Добавить комментарий

    Защитный код
    Обновить