Главная Биохимический анализ крови Методы исследования (для профессионалов медицины) Определение уровня ЛДГ в крови
Биохимический анализ крови - Методы исследования (для профессионалов медицины)

ЛДГПринцип метода определения ЛДГ

Лактатдегидрогеназа (L-лактат; НАД-оксидоредуктаза) ката­лизирует превращение лактата в пируват при одновременном вос­становлении НАД в НАД(Н), который далее восстанавливает в присутствии N-метилфеназонийметилсульфата йоднитротетразолиевый фиолетовый в красный формазан.

Одновременно с определением общей каталитической актив­ности лактатдегидрогеназы можно определять и долю фермента, устойчивого к действию мочевины, что характерно главным об­разом для изофермента сердечной фракции.

Пределы активности ЛДГ:

1. лактатдегидрогеназа (ЛДГ) при температуре 37 °С — 0,66—2,66 мккат/л;

2. доля фермента, устойчивая к действию мочевины (%), — 60—80.

Необходимые реактивы для определения ЛДГ

1. Молочная кислота 80%-ная.

2. Натрия гидроокись, растворы 2 моль/л; 0,4 моль/л.

3. 0,45 моль/л раствор лактата натрия. В мерную колбу вмес­тимостью 100 мл вносят 5 мл 80%-иой молочной кислоты, добав­ляют 2 моль/л раствора едкого натра до получения рН 7,5 и дово­дят объем водой до метки. Хранят в посуде из темного стекла в холодильнике.

4. Натрия пирофосфат (Na4P2О7 X 10 Н2О).

5. НСl 1 моль/л.

    6.   Натрия пирофосфат 0,03 моль/л, рН 8,8: 6,69 г натрия пирофосфата растворяют в небольшом количестве воды, добавляют 1 моль/л раствор НС1 до получения рН 8,8 и доводят объем водой до 500 мл. Стабилен в течение месяца при хранении в холодильнике.

    7.  НАД-окисленная форма. Готовят из расчета 3 мг НАД на 1 мл воды. Раствор стабилен в течение 4 недель при хранении в холодильнике.

    8.   Раствор 2,4-динитрофенилгидразина: 19,8 мг 2,4-динитрофенилгидразина растворяют в небольшом количестве 1 моль/л раствора НС1 при нагревании на водяной бане. После охлаждения доводят объем 1 моль/л раствором НСl до 100 мл. На следующий день реактив фильтруют. Раствор хранят в посуде из темного стекла. Стабилен в течение 1 года.

    9.  Пируват натрия (для построения калибровочной кривой): 11мг кристаллического пирувата натрия растворяют в небольшом количестве бидистиллированной воды, переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят водой объем раствора до метки; 1 мл раствора содержит 88 мкг пировиноградной кислоты. Рабочий раствор готовят разведением основного раствора в 10 раз бидистиллированной водой; 1 мл рабочего раствора содержит 8,8 мкг пировиноградной кислоты.

    Ход определения ЛДГ

    informerОпытная проба: 0,1 мл сыворотки, разведенной 1:2, смешива­ют с 0,3 мл раствора НАД, прогревают 5 минут при температуре 37°С. Затем добавляют 0,8 мл 0,03 моль/л раствора пирофосфата натрия и 0,2 мл 0,45 моль/л раствора лактата натрия, предвари­тельно прогретых при температуре 37 °С, и инкубируют смесь при температуре 37°С в течение 15 минут. Тотчас после инкубации добавляют 0,5 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина, выдер­живают 20 минут при комнатной температуре. Затем добавляют 5 мл 0,4 моль/л раствора едкого натра, перемешивают и через 10 минут измеряют на фотоэлектроколориметре (ФЭКе) в кювете с толщиной слоя 1 сантиметр при длине волны 500—560 нм (зеленый светофильтр) против хо­лостой пробы. Холостую пробу ставят так же, как опытную, но сыворотку добавляют после инкубации.

    Расчет активности производят по калибровочному графику.

    Построение калибровочного графика: из рабочего калибро­вочного раствора пирувата натрия готовят ряд разведений, как указано ниже.

    Затем в пробирки приливают по 0,5 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина. Далее калибровочные пробы обрабатывают и измеряют так же, как опытные. Холостую пробу ставят так же, как калибровочную, но вместо калибровочного раствора добавля­ют воду. Линейная зависимость между концентрацией пировиноградной кислоты и оптической плотностью сохраняется от 0 до 3000 нмоль/(с · л).

    Исследование активности лактатдегидрогеназы

    Номер про­бирки

    Рабочий калибро­вочный раствор пи-рувата нат­рия, мл

    0,03 моль/л раствор пирофос-

    фата натрия,

    мл

    Би-дистил-лирован-ная вода, мл

    Содержание пиро­виноградной кис­лоты в калибро­вочной пробе

    Актив­ность ЛДГ,

    нмоль/(с Хл)

    мкг

    мкмоль

    11

    00,1

    00,8

    00,5

    00,88

    00,1

    3334

    22

    00,2

    00,8

    00,4

    11,76

    00,2

    6668

    33

    00,4

    00,8

    00,2

    33,52

    00,4

    1336

    44

    00,6

    00,8

    55,28

    00,6

    2004

    55

    00,8

    00,6

    77,04

    00,8

    22672

     

    Добавить комментарий

    Защитный код
    Обновить