Главная Биохимический анализ крови Методы исследования (для профессионалов медицины) Определение активности креатинкиназы
Биохимический анализ крови - Методы исследования (для профессионалов медицины)

креатининПринцип метода определения активности креатинкиназы

Креатинкиназа катализирует превращение креатинина в креатинфосфат. Ион фосфата, освобожденный при гидролизе креатинфосфата, определяют после депротеинирования как желтый комплекс фосфорнованадиевомолибденовой кислоты.

Посуда для определения креатинкиназы не должна содержать следы фосфатов.

Повторные внутримышечные инъекции могут вызвать значи­тельное повышение концентрации креатинкиназы в сыворотке крови.

Пределы активности креатинкиназы:

- мужчины — 10—65 Ед/л X 0,017 или 0,17—1,11 мккат/л;

- женщины — 7—55 Ед/л X 0,017 или 0,12—0,94 мккат/л.

Необходимые реактивы для определения активности креатинкиназы

1.   Аденозин-5-трифосфорной кислоты динатриевая соль.

2.   L-цистеин, 0,024 моль/л: 2,9 мг растворяют в 1 мл воды. Гото­вят раствор перед употреблением. На одну пробу требуется 0,1 мл.

3.   Креатин.

4.   Магния сульфат 7-водный.

5.   Аммоний молибденовокислый 4-водный, 0,02 моль/л: 2,5 г молибденовокислого аммония растворяют в мерной колбе в 70— 80 мл воды и доводят объем до 100 мл водой.

6.   Натрия сульфат безводный.

7.   Натрий пиросернистокислый (метабисульфит натрия).

8.   1-амино-2-нафтол-4-сульфокислота (эйконоген).

9.  Серная кислота, 2,5 моль/л.

10.   НС1, 0,1 моль/л.

11.   Трис-(оксиметил)-аминометан (трис).

12.   Трисбуфер, 0,133 моль/л, рН 9,0:1,61 г трис растворяют в мерной колбе вместимостью 100 мл в 50—60 мл воды, устанав­ливают рН буфера 0,1 моль/л раствором НС1 и доводят водой до метки.

13. Раствор эйконогена: 15,36 г пиросернистокислого натрия, 0,512 г сернистокислого натрия и 0,128 г эйконогена растворяют в 70—80 мл воды, взбалтывают, доводят объем водой в мерной колбе до 100 мл и дважды фильтруют (через 2 часа и через сутки пос­ле приготовления). Раствор следует беречь от яркого света; в слу­чае выпадения осадка вновь фильтруют. Стабилен в течение 1 ме­сяца при хранении в холодильнике.

14. Основная смесь реактивов, содержащая 0,02 моль/л суль­фата магния, 0,033 моль/л креатина и 0,0067 моль/л аденозина трифосфат (АТФ): 0,4920 г сульфата магния, 0,4326 г креатина и 0,3692 г аденозина трифосфата (АТФ) растворяют в 70—80 мл трисбуфера (для полного растворения креатина смесь нагревают в течение 5—10 минут на водяной бане при темпе­ратуре 40—45 °С). Затем объем основной смеси реактивов дово­дят трисбуфером в мерной колбе до 100 мл.

15. Трихлоруксусная кислота, 4,9 моль/л: 80 г ТХУ растворя­ют в 50—60 мл воды и объем раствора доводят в мерной колбе до 100 мл.

16. Смесь растворов для проведения кислотного гидролиза креатинфосфата. Смесь готовят перед употреблением, учитывая, что на одну пробу расходуют 2 мл. Смесь состоит из 0,25 мл раствора молибденовокислого аммония, 0,25 мл раствора серной кислоты и 1,5 мл воды (соотношение 1:1:6).

17. Калия фосфат однозамещенный безводный (для приготов­ления калибровочного раствора): 0,0169 г КН2Р04 растворяют в воде и объем раствора доводят в мерной колбе до 100 мл.

Специальное оборудование для определения активности креатинкиназы:

 Фотоэлектроколориметр.

Ход определения активности креатинкиназы

Предварительно все растворы реактивов прогревают в течение 5 минут при температуре 37°С. Опытная проба: в пробирку вносят 1,5 мл основной смеси реактивов, 0,1 мл раствора цистеина и 0,4 мл сыворотки крови.

Содержимое пробирки осторожно перемешивают и ставят в термостат при температуре 37°С на 30 минут. Затем прибавляют 0,2 мл раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают стек­лянной палочкой и центрифугируют при скорости 3000 об./мин в течение 10 минут. Холостую пробу ставят так же, как опытную, но сыворотку добавляют после прибавления раствора трихлорук­сусной кислоты. Из опытной и холостой проб забирают по 1 мл надосадочной жидкости и переносят в химические пробирки (маркированные соответствующим образом), в которых содер­жится по 2 мл смеси растворов для проведения специфического гидролиза креатинфосфата. Полученную смесь растворов пере­мешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 минут (время гидролиза креатинфосфата). После этого в пробы добав­ляют с интервалом в 1 минуту по 0,25 мл раствора эйконогена и точно через 15 минут опытную пробу измеряют против холостой пробы при длине волны 600—700 нм (красный светофильтр) в кювете с толщиной слоя в 0,5 сантиметра


Расчет производят по калибровочному графику. Построение калибровочного графика; готовят калибровочные пробы.

Исследование активности креатинкиназы

Номер про­бирки

Калибро­вочный раствор, мл

Дистилли­рованная вода, мл

Количество

фосфора в пробе, мкг

Активность

КК, нмоль/(с X л)

1

1,0

14,4

1

45

2

1,0

7,7

2

90

3

1,0

5,13

3

135

4

1,0

2,85

4

180

5

1,0

2,08

5

225

Из каждого калибровочного раствора берут по 0,4 мл и обра­батывают так, как опытные пробы. В холостую пробу вместо ка­либровочных растворов берут по 0,4 мл воды.

Примечание

Если активность креатинкиназы (КК) превышает 500 нмоль/(сХл), то время ин­кубации сокращают до 15 или 10 минут; полученные величины ак­тивности умножают соответственно на 2 или 3. Разбавлять сыво­ротку не рекомендуется, так как активность фермента при разведении сыворотки изменяется непропорционально.

P.S. Ландшафтный дизайн своими руками - реально и очень просто. Правильная и красивая расстановка деревьев, кустов, цветов и прочей зелени на земельном участке дело занимательное и более чем интересное. 

 

Добавить комментарий

Защитный код
Обновить