Главная Биохимический анализ крови Методы исследования (для профессионалов медицины) Определение ГГТ в крови
Биохимический анализ крови - Методы исследования (для профессионалов медицины)

ГГТПринцип метода определения ГГТ в крови

Гамма-глутамилтрансфераза (ГГТ, гамма-ГТФ) переносит глутамиловый остаток с L-(+)глутамил-4-нитроанилина на дипептидный акцептор, которым является глицилглицин, служащий одновре­менно и буфером.

Концентрацию освобожденного 4-нитроанилина измеряют фотометрически, после остановки ферментативной реакции подкислением.

Пределы активности ГГТ:

- мужчины — 11-49 Ед/л X 0,017 или 0,19—0,83 мккат/л;

- женщины — 7—32 Ед/л X 0,017 или 0,12—0,54 мккат/л.

Необходимые реактивы для определения ГГТ

1.  L-глутамил-n-нитроанилид.

2.  Натрия хлорид.

3.  Глицилглицин, 0,55 моль/л, рН 8,3: 3,63 г глицилглицина помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доливают до метки водой и растворяют (буферный раствор).

4.  Субстратно-буферный раствор: в пробирку наливают 10 мл воды, добавляют 0,028 г L-глутамилпнитроанилида и 0,082 г хлорида натрия и, не переставая мешать, растворяют содержимое пробирки на кипящей водяной бане в течение 60 секунд. Затем раствор охлаждают до температуры 37°С и добавляют 2,5 мл буферного раствора.

Приготовленный раствор субстрата во время работы хранят в водяной бане при 37°С. Неиспользованный раствор субстрата можно хранить в холодильнике в течение недели. Субстрат пло­хо растворим, и при комнатной температуре выпадает в осадок. Поэтому перед употреблением выкристаллизовавшийся субстрат растворяют нагреванием в кипящей водяной бане. Нагревание и растворение субстрата можно повторить не более 2 раз.

5.  Уксусная кислота ледяная, раствор 100 г/л: 10 мл кислоты доводят водой до 100 мл.

6.  Основной калибровочный раствор n-нитроанилина: 0,0829 г n-нитроанилина помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят до метки водой и растворяют. Для определения активно­сти гамма-глутамилтрансфераза (ГГТ) можно пользоваться набором реактивов «Лахема».

бесплатный салон красоты дешелиХод определения ГГТ

Опытная проба: в пробирку вносят 0,5 мл раствора субстрата и помещают в водяную баню при температуре 37°С, приливают 0,05 мл сыворотки крови; содержимое перемешивают и инкуби­руют точно 15 минут при температуре 37°С. Затем прибавляют 3 мл раствора уксусной кислоты и перемешивают. Холостую пробу ставят так же, как опытную, но сыворотку добавляют после инку­бации.

Измеряют на спектрофотометре при длине волны 410 нм или на фотоэлектроколориметр (ФЭК) при длине волны 400—500 нм (фиолетовый или синий светофильтр) в кювете с толщиной слоя в 1 сантиметр против холостой пробы. Окраска стабильна в течение нескольких часов.

Расчет активности производят по калибровочной кривой. По­строение калибровочной кривой: из основного калибровочного раствора готовят рабочие растворы.

Определение активности гамма-глутамилтранспептидазы (ГГТ)

Номер калибро­вочного раство­ра

Калибровочный раствор п-нит-роанилина, мл

Дистиллиро­ванная вода, мл

Активность

ГГТ, нмоль/(с X л)

1

0,25

3,75

417

2

0,50

3,50

833

3

1,00

3,00

1667

4

1,00

1,00

3334

5

1,50

0,50

5001

6

2,00

6668

В каждую из 6 пробирок наливают по 0,05 мл рабочих калиб­ровочных растворов № 1—6, прибавляют по 3,5 мл раствора ук­сусной кислоты, перемешивают и измеряют экстинкцию против раствора уксусной кислоты при тех же условиях, что и опытную пробу. По полученным значениям экстинкции строят калибровоч­ную кривую. Линейность калибровочного графика сохраняется до активности 5000 нмоль/(с · л).

 

Добавить комментарий

Защитный код
Обновить