Главная Биохимический анализ крови Методы исследования (для профессионалов медицины) Диацетилмонооксимный метод определения мочевины
Биохимический анализ крови - Методы исследования (для профессионалов медицины)

мочевинаПринцип метода определения мочевины

Мочевина образует с диацетилмонооксимом в сильнокислой среде в присутствии тиосемикарбазида и ионов трехвалентного железа красный комплекс.

Необходимые реактивы для определения мочевины

1.  Трихлоруксусная кислота, 100 грамм/литр.

2.  Диацетилмонооксим, 25 грамм/литр водный раствор. Реактив стабилен.

3.  Тиосемикарбазид, 2,5 грамма/литр водный раствор. Для приготовле­ния реактива можно пользоваться также тиосемикарбазида гидро­хлоридом; последний применяется в виде 3,2 грамма/литр водного раство­ра. Оба реактива стабильны при хранении в темной посуде при комнатной температуре.

4.  Серная кислота концентрированная.

5.  Ортофосфорная кислота 85%-ная.

6.  Хлорное железо. Основной раствор хлорного железа: 5 грамм хлорного железа доводят до 100 миллилитров водой и подкисляют добавле­нием 1 миллилитр концентрированной серной кислоты. Из основного раствора готовят рабочий раствор хлорного железа: 1 миллилитр основно­го раствора хлорного железа доводят до 100 миллилитров водой, затем до­бавляют 8 миллилитров концентрированной серной кислоты и 1 миллилитр 85%-ной ортофосфорной кислоты. Хранят в темной посуде. Годен в тече­ние 2 недель.

7.  Бензойная кислота, 2 грамма/литр. 0,2 грамма кристаллической бензойной кислоты растворяют в 100 миллилитров воды при интенсивном перемеши­вании на водяной бане.

8.  Мочевина для приготовления калибровочного раствора. Го­товят 7 ммоль/литр раствор мочевины: 42 миллиграмма мочевины растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 100 миллилитров. В качестве растворителя можно использовать 2 грамма/литр раствор бензойной кислоты. Ка­либровочный раствор, приготовленный на растворе бензойной кислоты, стабильнее, чем водный; 1 миллилитр калибровочного раствора содержит 0,007 ммоль мочевины.

9. Цветной реактив: к 30 миллилитрам рабочего раствора хлорного желе­за добавляют 20 миллилитров воды, 1 миллилитр 25 грамм/литр раствора диацетилмонооксима и 0,25 миллилитра 2,5 грамм/литр раствора тиосемикарбазида. Цветной реак­тив готовят каждый раз перед употреблением.

Ход определения мочевины в сыворотке крови

Опытная проба: в центрифужную пробирку наливают 0,8 миллилитра во­ды, 0,2 миллилитра сыворотки и 1 миллилитр 100 грамм/литр раствора трихлоруксусной кис­лоты, смешивают. Через 15— 20 минут центрифугируют. В чистую пробирку вносят 0,5 миллилитра надосадочной жидкости и 5 миллилитров цветного реактива. Пробирку выдерживают на кипящей водяной бане в те­чение 20 минут, затем охлаждают в течение 2—3 минут под проточ­ной водой. Измерение проводят на фотометре при длине волны 530—560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы в кю­вете с толщиной слоя в 1 сантиметр. Холостую пробу ставят так же, как опытную, но вместо надосадочной жидкости берут 0,5 миллилитра воды.

Расчет проводят по формуле путем сравнения с калибровоч­ной пробой.

Калибровочную пробу ставят аналогично опытной, но вместо сыворотки берут 0,2 миллилитра калибровочного раствора.

Концентрация мочевины, ммоль/л:

Е опк · С к ,

где Еол — экстинкция опытной пробы;

Ек — экстинкция калибровочной пробы;

Ск — концентрация мочевины в калибровочном растворе, 7 ммоль/л.

Определение мочевины в моче проводят аналогично опреде­лению мочевины в сыворотке крови, но вместо сыворотки берут 0,2 миллилитра разведенной мочи. Параллельно обрабатывают калибро­вочную пробу, как описано для определения мочевины в сыво­ротке крови. Расчет мочевины на суточное количество мочи производят по следующей формуле:

М сут = С к · Е оп · а ·К/Е к · б,

где М сут  — количество мочевины в суточной моче, ммоль;

Ет — экстинкция опытной пробы;

Е к — экстинкция калибровочной пробы;

Ск — содержание мочевины в калибровочном растворе, ммоль;

а — суточное количество мочи, мл;

б — количество мочи, взятое на анализ, мл;

К — коэффициент разведения мочи.

Примечания

1. Измерение проводят не позже чем через 15 минут после охлаждения проб ввиду неустойчивости окраски.

2. Из-за неустойчивости окрашенного комплекса мочевины с диацетилмонооксимом и зависимости окраски от условий на­гревания калибровочную пробу определяют параллельно каждой серии опыта.

3. При содержании мочевины в сыворотке крови выше 17 ммоль/литр сыворотку разводят изотоническим раствором хлори­да натрия, а результаты умножают на коэффициент разведения.

4. Для пересчета на азот мочевины результаты следует разде­лить на 2,14.

Данный метод исследования мочевины крови широко используется.  

 

Добавить комментарий

Защитный код
Обновить